综述肺肿瘤微环境免疫治疗放疗

TranslLungCancerRes.Apr;6(2):–.

doi:10./tlcr..03.06

Uncoveringtheimmunetumormicroenvironmentinnon-smallcelllungcancertounderstandresponseratestocheckpointblockadeandradiation

标题：揭开NSCLC免疫肿瘤微环境以理解检查点抑制剂阻滞和放射的应答率

摘要：免疫学的研究已经在治疗非小细胞肺癌(NSCLC)方面取得了突破。最近批准了一种针对NSCLC的抗PD1检查点药物，这引起新联合治疗可能为患者带来更多好处的更大兴趣。然而，更好的理解哪些联合可能(或可能不会)在NSCLC中起作用，需要理解在稳态条件下的肺免疫微环境以及在癌症进展和放射治疗情况下微环境的变化。这篇综述提供了关于肺中发现的免疫细胞的基础信息以及这些细胞类型在肺癌中的预后意义。它还解决当前NSCLC检查点抑制剂与放射联合的临床方向。

1、肺作为一个免疫器官

由于肺部经常受到外来病原体和微粒的影响，因此建立了良好的机制来迅速消除这些和其他类型的入侵物。首先，上呼吸道覆盖着许多抗菌化合物的粘液。这种粘液是不断地由球状细胞分泌,纤毛上皮细胞排出。排列于呼吸道上皮细胞也表达模式识别受体(PRRs)识别与病原体相关分子模式和其他危险的颗粒或细胞,这些细胞不仅可以调节通过各种途径对感染的反应,他们也可以识别,处理,杀死病原体。这些上皮细胞也通过细胞因子识别和分泌直接对免疫反应进行引导，而肺的下一个防线则是免疫细胞。组织居留的肺泡巨噬细胞很容易被吞噬和清除碎片。事实上，肺空间白细胞的95%是肺泡巨噬细胞，很少有淋巴细胞或中性粒细胞，肺中的各种细胞，包括肺泡巨噬细胞、树突细胞(DCs)和粒细胞也表达PRRs，能引起稳态受干扰的免疫反应。这就能迅速地将其他免疫细胞迅速地招募到肺里，这样就能产生有效的反应，并清除存在的病原体。

肺里的一种重要的细胞类型是淋巴细胞。在一个研究中，肺里各种淋巴细胞的存在情况，黄等人利用time-of-flight(CyTOF)血细胞计数查询健康捐赠者淋巴细胞子集，通过识别细胞表面和细胞内蛋白表达。CD8+T细胞和CD4+T细胞在肺组织的最普遍的亚型,不过，自然杀伤(NK)细胞和NKT细胞也存在。在肺里发现的B细胞很少。在体外刺激肺培养物检测细胞内细胞因子，发现肺中最普遍的CD4+细胞是T辅助I（Th1;表达干扰素-γ，IFN-γ)，尽管检测到T辅助II（Th2;表达白介素(IL-4)）和调节T细胞(Treg，表达IL-10)低水平。有趣的是，在肺里的表达的颗粒性巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)CD4+T细胞表达也非常高，与IFN-γ表达重叠;T细胞产生的GM-CSF影响了DC的成熟，并导致免疫系统紊乱，特别是多发性硬化症。

2、癌症进展期间免疫变化

免疫系统关于癌症的进展分为三个阶段:消灭、平衡和逃逸。在消灭阶段，免疫系统会主动攻击癌细胞(图1)，在肿瘤与免疫系统达到平衡后，肿瘤最终从免疫系统逃逸。然后，肿瘤开始生长。以下部分描述了免疫系统的变化，这些变化导致了临床相关的NSCLC，特别是目前对来自临床前模型的癌症和癌症结果相关的免疫细胞的理解，通过硅测序和临床证据。

3、临床研究肺癌免疫变化

大量的临床前研究都集中在肺肿瘤微环境(TME)上，以揭示肿瘤是如何逃脱免疫监视的。在一项关于Lewis肺癌(LLC)模型的研究中，死亡受体Fas与肿瘤细胞配体的相互作用并没有促进细胞凋亡，反而通过分泌前列腺素E2(PGE2)引起招募髓系抑制细胞(MDSCs)到肿瘤。PGE2已经在炎症和促进癌症的背景下得到了很好的研究。该研究还表明，在肿瘤细胞上过度表达Fas增强MDSC和Treg浸润到肿瘤中，发现通过抗gr1抗体抑制MDSCs可以延缓肿瘤的生长。另一组研究人员还发现，在LLC模型中，Fas过度表达导致了肿瘤生长，注意到MDSCs样细胞是在香烟烟雾的反应中积累起来的，但这些细胞在肿瘤形成之前并没有获得抑制免疫功能。

靶向药物如吉西他滨或精氨酸酶抑制剂可以促进T细胞在肺TME中的浸润。铃木等人也在LLC模型，发现吉西他滨导致脾脏MDSCs数量的减少，而据报道，MDSCs的丢失会增加肿瘤生长延迟在小和大的AB12间皮瘤。

除了PGE2其他因素在临床前肺癌模型中影响炎症。Kim等发现，肿瘤细胞分泌一种细胞外基质蛋白，名为多功能糖细胞，它能刺激巨噬细胞中的toll样受体(TLR)2，并促进促炎性细胞因子的产生，特别是IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)。当TLR2在小鼠体内被敲除时，这种效应就被废除了;有趣的是，这些老鼠更少的肺和肝肿瘤，而且生存时间延长。此外，阻断单核细胞的化学趋化蛋白-1，也称为CCL2，可以抑制肿瘤生长和自发转移。一旦CCL2被阻滞，发现巨噬细胞会从促肿瘤的M1表型转变为M1表型，而这种抗肿瘤效果还取决于CD8+T细胞;即使CD8+T细胞的百分比没有增加，这些细胞的激活标记CD25和41BB的表达也增加了一倍。

中性粒细胞对肺TME的影响，在一个基于甲基胆蒽和羟基甲苯肺癌模型进行了研究。在一项研究中，Ly6G+中性粒细胞删除导致了肿瘤位点数明显减少。然而，一旦肿瘤形成，中性细胞的删除并不会影响肿瘤的生长。这些结果表明，中性粒细胞可能对肿瘤的发生和转移很重要，而不是肿瘤的生长。

总的来说，这些研究表明肿瘤完全有能力招募和极化髓系细胞来阻止适应性免疫。也意味着，慢性炎症可能是导致这些细胞聚集在肺TME的重要因素。

4、使用硅胶方法调查肺癌免疫变化

在过去的十年中由于技术限制阻碍深入调查人类TME,困难包括识别和研究特定类型的肿瘤细胞瘤内异质性和识别功能差异如在特定的细胞子集不同的基因表达模式,很大程度上是因为无法解决单个细胞或细胞类型的基因表达差异。然而，近年来单细胞基因组学、转录组学和计算技术的进步，便于调查瘤内异质性属性在细胞类型和浸润细胞功能行为(如：PD1表达于CD4+T细胞表面)。

单细胞“组学”的大部分工作仅限于对肿瘤基因组水平的克隆多样性和肿瘤进化的研究，在评估非肿瘤细胞方面的努力相对有限。一个新的方式区分肿瘤样本的细胞类型单个表达谱是通过应用线性支持向量回归算法,这种方法最近被提出和测试来自多名患者癌症现有肿瘤数据从基因组图谱(TCGA)和DNA序列元素的百科全书(编码)。该方法利用来自肿瘤样品的基因表达数据，通过基于已知的纯化细胞类型的基因片段的表达水平，对细胞成分进行推断，从而量化了细胞类型的构成。

这项研究的先驱们对跨一定范围的实体肿瘤细胞类型的肿瘤浸润免疫细胞进行了评估，发现免疫细胞的特定亚型的占优势似乎是阳性预测因子。具体地说，在肺腺癌中，他们发现大量的未激活的肥大细胞，灭活的CD4记忆T细胞，以及幼稚和记忆B细胞和血浆细胞与良好的预后有密切的联系。另一方面，大量的多形核细胞和其他骨髓来源的细胞与预后不良强相关。出乎意料的是，活性CD4+记忆T细胞的存在也与预后差密切相关。

在肺鳞状细胞癌中，大多数的骨髓细胞似乎都与不良的预后相关，如记忆B细胞和静止的CD4记忆T细胞。然而，激活的树突细胞的存在是有利的，如激活的CD4记忆、CD8和γδT细胞。在两组肺癌中，未激活的肥大细胞的出现与预后良好有关。其他的临床前研究正在进行，例如，更深层的表型——例如，是否有特定的CD4T辅助细胞的特定子集，它们在肿瘤中的存在能提高癌症的预后?辅助T细胞的记忆状态如何影响TME?TME是否基于患者的年龄而有所不同?一些证据表明，炎症随着年龄的增长而增加，并通过MDSCs来调节。对肺TME的进一步研究可能有助于回答这些问题。

5、肺癌免疫细胞与临床相关

许多组织都试图通过使用组织微阵列和免疫组织化学染色等技术来对肺癌患者的免疫细胞亚群进行分析。大多数这样的研究都是在切除肿瘤样本后进行的，这些样本被染色以评估免疫亚群的数量，以及它们与手术后生存之间的关系。涉及血液的生物标记物的研究包括了来自不同形式的患者的样本。

巨噬细胞

由于骨髓细胞在肺中普遍存在，许多人已经研究了它们的作用，即肿瘤抑制(M1)或肿瘤促进(M2)巨噬细胞亚型。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、极化,及其在肺癌定位与预后相关，表明巨噬细胞渗透到肿瘤小岛或巢或M1极化与更好的肺癌患者的生存相关,而TAM密度,他们存在于肿瘤基质,和/或M2极化与更差的生存相关。其他研究小组发现，在蛋白质水平上TAMs（非肿瘤）的IL-10表达(M2相关)与更差的总生存OS相关，而TAMs中的高IL-10mRNA水平与肿瘤侵犯有关。尽管一些研究发现，TAMs与肿瘤进展之间没有相关性，但大多数研究都与肺癌进展有关。

在肺癌的预后中，TAMs肿瘤浸润可能不是唯一相关的与巨噬细胞相关的因素。一组研究显示肺泡巨噬细胞(通过肺肿瘤患者支气管肺泡灌洗)降低了吞噬能力。用PGE2培养肺泡巨噬细胞也导致了吞噬细胞的减少。另一组类似研究表明，肺泡巨噬细胞增加了诱导的一氧化氮合酶(iNOS)的水平，这是一种传统的M1巨噬细胞极化标记。除了PGE2外，慢性炎症也被认为影响巨噬细胞功能，减少其吞噬能力，可能是由于由肺泡巨噬细胞或其他骨髓细胞产生的炎症细胞因子。一组研究发现IL-6和IL-1升高在非小细胞肺癌患者相对于良性肺病患者,而另一项研究显示TNF-α和IL-6水平升高,但不是IL–1在非小细胞肺癌患者,表明肿瘤可能影响肿瘤部位TAMs和整个肺的肺泡巨噬细胞。值得注意的是，IL-1,IL-6和TNF-α往往与M1巨噬细胞有关。这些巨噬细胞会有助于肿瘤的生长吗?正如上文提到的LLC和TLR2临床前研究所指出的那样?肿瘤影响巨噬细胞功能的能力可能在空间上是有限的，正如一项研究表明，非癌性肺叶中的肺泡细胞并没有分泌如癌症的肺叶分泌的大量TNF-α。另一项从受影响区域中获得的支气管肺泡样品的研究中显示受损的吞噬细胞。一项附加研究表明，在1-3期肺癌患者中，来自胸腔和周围血单核细胞的巨噬细胞在产生上述促炎细胞因子的同时保留了吞噬细胞的吞噬能力。这些研究表明，这些类似M1型的巨噬细胞可能没有抗肿瘤功能，因为它们已经丧失了一些吞噬能力，而且容易产生炎症性的环境。虽然这些细胞因子对抗肿瘤的作用很重要，但有证据表明，TNF-α,IL-6,和IL-1也可能参与癌症的进展。

对与肺癌结果相关的肿瘤相关中性粒细胞的研究较少。一项研究显示，CD10表达与OS差有关而另一项研究显示CD10+和CD10-肿瘤之间OS没有差别，而且这些冲突研究都已发表。不过，在前一项研究中，作者比较了高CD10表达肿瘤和低CD10表达的肿瘤，而后者的研究只比较了CD10+和CD10-肿瘤。基于高、低或无表达的比较可能会显示出更清晰的与总生存OS之间的相关性，正如研究表明，比较NSCLC患者的血液中中性粒细胞和淋巴细胞的比率与生存相关。一项针对14项研究的荟萃分析，比较这一比率与生存结果，证实了更高的中性粒细胞与淋巴细胞比率，与肺癌患者更差的生存有相关性。有趣的是，一项研究发现，单独的中性细胞单独计数增多就足以预测患者差的生存，这意味着全身炎症可能是癌症患者的一个危险因素。最后，从早期的肺肿瘤中分离出来的中性粒细胞似乎表现出了免疫刺激的特性;在一项研究中，由来自肿瘤切除的中性粒细胞与T细胞一起培养通过共刺激分子4-1bbl、OX40L和CD86来驱动T细胞增殖。

MDSCs血液水平升高可能与较差生存相关。一组人在NSCLC患者的血液样本中对MDSCs进行了分析，发现较高水平的MDSCs，以及较低水平的树突细胞和单核细胞，与更差的生存状况相关。另一个类似的研究没有发现MDSC水平和生存之间的关系,而是与非小细胞肺癌患者血液中MDSC水平普遍升高,与更少的CD8+T细胞相关,这意味着MDSCs可能有更多的全身性作用与M2TAMs相比,M2TAMs似乎只在本地变化。

在肿瘤患者中，有三级淋巴样结构的存在。年的第一个此类研究报告显示，接受外科切除手术的病人，这些结构只存在于肿瘤中，而不是在肺健康的区域中。发现这些三级淋巴结构含有DCs，而高水平的dc-lamp+DCs(一个成熟标记)与改善无病生存率相关。值得注意的是，有dc-lamp水平的肿瘤也有更多的T细胞浸润，更多的B细胞，更多的T-bet+Th1(辅助)细胞。三级淋巴结构似乎有能力通过几种机制来招募T细胞，它们的存在与基质和肿瘤中较高的T细胞数量相关。DC-Lamp-高肿瘤也与5年生存率的提高有关(60%和DC-Lamp低肿瘤40%)。另一项比较了B细胞和DC-Lamp+DCs的研究报告显示了相似的趋势:具有较高水平的成熟的树突细胞相应B细胞数量较多，这与较好生存有关。

淋巴细胞癌浸润性淋巴细胞(TILs)的重要性已经在几种类型的癌症中得到了充分的证明。一项大型临床研究(名患者)试图将不同的免疫标记与发生在I期腺癌(64位)的患者的复发概率联系起来。较高水平的基质叉头蛋白Foxp3(在Tregs中发现的转录因子)和IL-7受体与较高的复发几率相关。然而，如果高Foxp3水平与基质中高CD3水平相关，结果却与低Foxp3水平相似，暗示T细胞浸润水平超过肺癌的Treg水平。同样的研究也表明，在肿瘤内的IL-12受体beta2的水平与更低复发几率有关。最近的一项荟萃分析，目的是评估肺癌患者的TILs的子集和预后，指出高水平的CD3+和CD8+T细胞与存活率的提高有关，但较高的基质Foxp3水平可能是相反。

B细胞对生存率的影响尚不清楚。如前所述，三级淋巴结构似乎能够在肿瘤附近的B细胞中存活，而B细胞的存在与存活率的提高相关，尽管这一发现并不一致。另一项研究表明，在基质区域中IgG4表达的血浆细胞的浸润与高生存率相关联，这一发现与硅的结果相一致。

证据将NK细胞与存活率提高联系起来。其中一组研究使用CD56作为NK细胞的标志物，发现88%的评估患者在基质中有较低的CD56，但11%的患者在手术后CD56高水平5年生存率更高(82%vs56%)。另一组在NK细胞浸润中发现了相似的结果。

6、来自肺肿瘤微环境的结论

TAMs、中性粒细胞、MDSCs和Treg都在肺TME中具有免疫抑制活性。巨噬细胞功能似乎在局部改变，而MDSCs可能影响全身。与其他类型的癌症一样，T细胞浸润在肺肿瘤中，成熟的DCs，NK细胞，令人惊讶的是，B细胞似乎与预后良好相关。

7、放射治疗与免疫应答

放疗(XRT)改变了TME的免疫反应存在争议。它增强了主要组织相容复合物MHCI的表达能力，使免疫系统能够对肿瘤新抗原作出反应。XRT还通过在肿瘤细胞表面的表达钙网蛋白，以及释放ATP和HMGB1，激活免疫性细胞死亡。XRT还可以通过多种机制来促进远处应答而无论是否联合免疫治疗，包括对不同的运载受体和CD8+T细胞的招募，即使淋巴细胞对辐射非常敏感，在XRT后不久就会被杀死。XRT效果一个深透研究是它能够提高转化生长因子-beta(TGF-β)水平。TGF-β对于Treg极化至关重要，在XRT之后增加Treg的提呈，不过，Treg对放射也有天生的抵抗能力。XRT也在向TME招募骨髓细胞起作用;XRT招募MDSCs和噬细胞依赖于辐射剂量，将巨噬细胞极化到M2显型。在LLC模型的一项研究中，CD18的低形态小鼠对20Gy小剂量XRT应答更好，因为它减少了骨髓细胞的招募。然而，另一组研究发现，较高的剂量(单次30Gy剂量)导致了以CD8+T为主细胞的招募，而这种分剂量(3Gy10次)导致了MDSCs的招募。实际上，在XRT之后这些相互冲突的结果可能有助于解释为什么一些患者会对治疗XRT和免疫疗法的治疗做出反应，尤其是免疫检查点的阻滞，而其他患者则没有反应。

8、免疫检查点抑制剂

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